Современные микроскопы со специальными линзами, конечно, могут рассматривать мелкие объекты и позволяют увидеть живые клетки или даже, например, бактерии, но этого все еще недостаточно для обнаружения вирусов — например, самого SARS-COV-2.
FAQ – Часто задаваемые вопросы по микроскопам
Практически каждый человек в какой-то момент соприкасался с микроскопом. Некоторые из нас изучали строение клеток лука или листьев растений на уроках биологии в школе. У некоторых с детства дома есть микроскоп.
Микроскоп полезен в любом возрасте, как в познавательном, так и в научном плане. Он помогает рассмотреть интересное насекомое, изучить строение обычных вещей и предметов. Он также необходим при выполнении точных работ.
Друзья, в этой статье мы продолжаем часто задаваемые вопросы об устройствах, продаваемых нашей компанией. На этот раз мы посвящаем статью микроскопам.
Общие вопросы о микроскопах
- Общие вопросы о микроскопах
- Для чего нужен микроскоп?
- Какой микроскоп лучше: цифровой или учебный (биологический)?
- Что лучше оптическое или цифровое увеличение?
- Если оптическое увеличение лучше цифрового, то зачем нужны цифровые микроскопы?
- Чем цифровой микроскоп лучше оптического микроскопа?
- Чем оптический микроскоп лучше цифрового микроскопа?
- Для чего нужны промышленные микроскопы?
- Какой микроскоп выбрать: монокулярный, бинокулярный или тринокулярный?
- Что означают цифры и буквы на объективе микроскопа?
- Как обозначается увеличение в микроскопах?
- Что означают цветные полосы на объективе микроскопа?
- Что означает буквенная маркировка на объективе микроскопа?
- Что такое числовая апертура объектива?
- Что такое иммерсия и иммерсионная среда?
- Для чего указывается длина тубуса на объективе и коррекция на бесконечность?
- Для чего указывается толщина покровного стекла на объективе?
- Как рассчитать увеличение микроскопа?
- Что такое рабочее расстояние микроскопа?
- Что такое парфокальное расстояние микроскопа?
- Какое стекло используется для линз микроскопа?
- Что можно увидеть в цифровой USB микроскоп?
- Что можно увидеть в биологический микроскоп?
- Что можно увидеть в стереоскопический микроскоп?
- Почему я не вижу в микроскоп объекты в объеме? Я же смотрю в микроскоп двумя глазами.
- Почему я не вижу объекты в микроскоп на большую глубину при больших увеличениях?
Для чего нужен микроскоп?
Микроскоп полезен ребенку для развития познавательных навыков и изучения окружающего мира. Для школьников и студентов он пригодится при выполнении научных заданий по биологии, зоологии, химии, физике и технике. Для взрослых микроскоп часто бывает полезен при выполнении точных работ, таких как ремонт электроники, изготовление ювелирных изделий, микромикрография, реставрация и многое другое. Микроскопы также полезны для научных исследований и изучения структуры поверхности природных и искусственных материалов.
Какой микроскоп лучше: цифровой или учебный (биологический)?
Тип микроскопа следует выбирать в соответствии с его назначением. Цифровые микроскопы, учебные микроскопы, промышленные микроскопы и биологические микроскопы — все они хороши, но их применение различно. Подробнее об этом читайте в статье «Взгляд через микроскоп».
Что лучше оптическое или цифровое увеличение?
Для получения максимального качества изображения — ориентируйтесь на оптическое увеличение. Чем выше он находится в микроскопе, тем четче будет изображение.
Глаз насекомого в микроскопе: оптическое увеличение (слева) и цифровое увеличение (справа).
Если оптическое увеличение лучше цифрового, то для чего цифровые микроскопы?
Цифровые микроскопы используются, когда не требуется большое увеличение, например, в ювелирной промышленности и для ремонтных и ревизионных работ.
Чем цифровой микроскоп лучше оптического микроскопа?
Цифровые микроскопы имеют много преимуществ, особенно
- плавный зум (оптические микроскопы имеют конкретные увеличения 100х, 400х, 800х и т.д.)
- настройка фокусного расстояния в широком диапазоне (у оптических МС фокусное расстояние зависит от объектива);
- встроенная камера для захвата фото и видео изображения;
- карта памяти для сохранения фото и видео;
- дополнительные выходы: HDMI, AV (для некоторых моделей);
- встроенный монитор (для некоторых моделей);
- пуль дистанционного управления микроскопом (для некоторых моделей).
Вопросы об объективах
Что означают цифры и буквы на объективе микроскопа?
На корпусе объектива указаны его кодированные характеристики и область применения. Краткие названия идентифицируют цель и описывают ее назначение и особые характеристики.
Как обозначается увеличение в микроскопах?
Увеличение объектива микроскопа обозначается арабскими цифрами с буквой «X». В технической документации вы найдете: «кратность» или аббревиатуру «кратность».
Например: «Увеличение 500», «500-кратное увеличение» или «500-кратное увеличение».
Иногда в стандартной маркировке объектива отсутствует буква «X».
Что означают цветные полосы на объективе микроскопа?
Цветная метка указывает на увеличение объектива. Эта маркировка полезна, когда основная маркировка стерлась или не видна через другие линзы в турели.
В следующей таблице приведена расшифровка цветных колов.
Черный или без цветовой маркировки
Некоторые увеличительные линзы могут быть доступны не у всех производителей.
Погружные линзы имеют двойную цветовую маркировку. Второе цветовое кольцо указывает на тип погружной среды.
В зависимости от производителя цветовые оттенки могут значительно отличаться.
Что означает буквенная маркировка на объективе микроскопа?
На линзе отмечается следующая информация: метод исследования, тип оптической коррекции, тип иммерсионной среды и другие характеристики.
Как и в случае с цветовым кодированием, короткие сокращения облегчают идентификацию.
Объяснение некоторых аббревиатур см. в таблице ниже.
Металлографический объектив (для использования без крышки).
Для использования без крышки.
Для работы в светлом и темном поле.
PH, Phase, PHACO, PC
Для фазово-контрастных исследований.
Для исследований с поляризованным светом.
Для исследования флуоресценции (люминесценции).
Для исследований с косым освещением и освещением EPI.
Для исследования дифференциального контраста.
Для интерференционных контрастных исследований.
Для исследования проходящего света.
Для исследований в темном поле.
Для ярких полевых исследований.
Для инфракрасной микроскопии.
ACH, AHRO, Achro, Achromat
Ахроматическая объективная линза с сильно искривленным полем зрения (до 35 %).
Полупланарный объектив со средней кривизной поля зрения (до 20 %).
Плоский объектив с минимальным искривлением поля зрения (до 5 %).
КОРРЕКЦИЯ ЦВЕТА (ХРОМАТИЧЕСКАЯ АБЕРРАЦИЯ).
Обесцвечивающая линза. Коррекция цветовых аберраций для трех цветов: красного, зеленого и синего.
Суперхроматический объектив. Корректирует хроматическую аберрацию в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне.
F, Fluor, Fl, Fluar, Neofluar, Fluotar
Фтористые или полупрозрачные линзы. Коррекция хроматической аберрации для двух цветов: красного и синего.
Большое рабочее расстояние.
Для использования с универсальной сценой.
Может быть погружен в воду (чтобы назвать среду погружения) или на рабочее расстояние.
W, вода, WI, вода
Любой другой или более чем один вид погружения.
Гомогенная (однородная) иммерсионная среда.
Объективный стандарт (Немецкий институт стандартизации). Длина трубы 160 мм, высота торца 45 мм.
Кратность увеличения цифрового микроскопа против кратности увеличения оптического микроскопа, что лучше?
Стандартные оптические микроскопы имеют окуляр, эквивалентный 10-дюймовому экрану, в то время как цифровые микроскопы часто используют стандартный 22-дюймовый экран и совместимы с еще большими экранами, телевизорами и даже проекторами.
Если смотреть только на поле зрения, то коэффициент увеличения цифрового микроскопа примерно на 100 % выше, чем у оптического микроскопа.
Как показано на рисунке 2, 40-кратное увеличение цифровой системы микроскопа эквивалентно 20-кратному увеличению оптической системы — в общем, возможны небольшие различия в зависимости от марки микроскопа.
Рисунок 2.
Размер поля зрения может быть использован в качестве ориентира для иллюстрации различий.
Если вы привыкли работать с оптическим микроскопом с определенным полем зрения и хотите работать с цифровым микроскопом с таким же полем зрения, например, по причинам валидации, то настройка очень проста. Поле зрения можно определить, поместив под микроскоп метрическую линейку, увеличив масштаб до нужного увеличения и измерив, сколько миллиметров вы можете видеть слева направо. Как только вы узнаете размер желаемого поля зрения, поместите линейку под цифровой микроскоп и увеличивайте масштаб (при необходимости меняя объективы), пока не достигнете такого же поля зрения.
Что влияет на кратность увеличения?
Чтобы рассчитать увеличение, необходимо знать:
- Размер используемого монитора
- Минимальное и максимальное поле зрения (в направлении X) на этом мониторе
Используемый монитор очень важен, поскольку от его размера зависит, насколько сильно вы сможете увеличивать и уменьшать изображение. Другими словами, при использовании 27-дюймового монитора можно добиться меньшего и большего увеличения, чем при использовании 24-дюймового монитора.
Пример: TAGARNO FHD Prestige с объективом +10 (ахроматический) может увеличить объект в 129 раз на 24-дюймовом экране. Но он может увеличивать в 145 раз на 27-дюймовом экране и в 116 раз на 22-дюймовом.
Как рассчитать кратность увеличения для цифрового микроскопа?
Формула очень проста: просто разделите ширину экрана на минимальное поле зрения (угловой диапазон, который видит человеческий глаз при неподвижной голове и фиксированном взгляде), чтобы найти минимально возможный уровень увеличения. Затем разделите ширину экрана на максимальное поле зрения, чтобы найти максимально возможный уровень увеличения.
Пример.
Чтобы найти минимально возможный уровень увеличения, разделите 531 мм (ширина экрана) на 125,1 (минимальное поле зрения), что составляет примерно 4,2 раза, чтобы найти минимально возможный уровень увеличения. Чтобы найти максимально возможный уровень увеличения, разделите 531 мм (ширина экрана) на 4,1 (максимальное поле зрения), что составляет примерно 129x.
Это означает, что рассматриваемый объект может быть увеличен с 4,2x до 129x на 24-дюймовом экране при использовании FHD Prestige с объективом +10 (ахроматическим).
Ниже приведена таблица, показывающая уровни увеличения для каждого объектива, предлагаемого компанией TAGARNO, при использовании 24-дюймового монитора. В таблице показано, что каждый объектив имеет свой диапазон увеличения. Выбор микроскопа и объектива зависит от объекта исследования и необходимого вам увеличения.
Линзы/
Микроскоп TAGARNO
ZAP
ZIP
TASE
ПРЕСТИЖ
Изображение.
Контраст в ОПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Если образец достаточно тонкий, количество рассеянных электронов невелико. Когда электроны проходят через образец, некоторые из них рассеиваются при столкновениях с атомными ядрами в образце, другие рассеиваются при столкновениях с электронами из атомов, а третьи проходят через образец, не рассеиваясь. Степень рассеяния в той или иной области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в этой точке. Электроны, которые покидают апертуру с угловым отклонением, превышающим определенный порог, не могут вернуться в несущий изображение пучок, поэтому области с сильным рассеянием, повышенной плотностью, увеличенной толщиной и тяжелыми атомными позициями появляются на изображении как темные области на светлом фоне. Такое изображение называется изображением яркого поля, поскольку окружающее поле ярче объекта. Однако система электрического отклонения может быть сконструирована таким образом, чтобы только часть рассеянных электронов проходила через апертуру линзы. Тогда образец выглядит ярче в темном поле. Объект со слабым рассеянием часто лучше изучать в режиме темного поля.
Окончательное увеличенное электронное изображение преобразуется в видимое изображение через люминесцентный экран, который светится под воздействием электронной бомбардировки. Это изображение, которое обычно имеет низкую контрастность, обычно проецируется через бинокулярный световой микроскоп. При одинаковой яркости такой микроскоп с увеличением в 10 раз может создать на сетчатке глаза изображение в 10 раз большее, чем то, которое видит невооруженный глаз. Иногда для подсветки слабого изображения используется люминофорный экран с электрооптическим преобразователем. В этом случае конечное изображение можно вывести на экран обычного телевизора, чтобы потом записать его на видеокассету. Видеозапись используется для записи изображений, которые изменяются во времени, например, по мере протекания химической реакции. Окончательное изображение обычно записывается на фотопленку или пластину. Фотопластинка обычно дает более четкое изображение, чем то, которое видно невооруженным глазом или записано на видеопленку, поскольку фотоматериалы, как правило, более эффективно захватывают электроны. Кроме того, на единицу площади фотопленки можно записать в 100 раз больше сигналов, чем на единицу площади видеокассеты. Это означает, что изображение на пленке может быть увеличено примерно в 10 раз без потери резкости.
Разрешение.
Электронные лучи имеют схожие свойства со световыми лучами. В частности, каждый электрон характеризуется определенной длиной волны. Эффективность разделения ЭМ определяется фактической длиной волны электронов. Длина волны зависит от скорости электронов и, следовательно, от ускоряющего напряжения; чем выше ускоряющее напряжение, тем выше скорость электронов и тем короче длина волны и, следовательно, выше разрешение. Это важное преимущество электромагнитного разрешения связано с тем, что длина волны электронов намного короче длины волны света. Однако, поскольку электронные линзы не могут фокусироваться так же хорошо, как оптические линзы (хорошая электронная линза имеет числовую апертуру всего 0,09, в то время как хорошая оптическая линза имеет числовую апертуру 0,95), разрешение ЭМ составляет около 50-100 длин волн электронов. Даже при использовании таких слабых линз в электронном микроскопе можно достичь предела разрешения около 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы в кристаллах. Достижение такого порядка разрешения требует очень тщательной настройки устройства, особенно очень стабильного источника питания, а само устройство (которое может быть высотой около 2,5 м и весить несколько тонн) и его компоненты требуют установки без вибраций.
SEM, который стал незаменимым инструментом для научных исследований, является хорошим дополнением к SPEM. В SEM используется электронная линза для фокусировки пучка электронов на очень маленьком участке. Можно настроить РЭМ так, чтобы диаметр пятна был не более 0,2 нм, но обычно это единицы или десятки нанометров. Это пятно непрерывно пересекает участок образца, подобно тому, как луч пересекает экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, генерируемый электронным пучком, бомбардирующим образец, используется для создания изображения на экране телевизора или катодно-лучевой трубки, сканирование которой синхронизировано с системой отклонения электронного пучка (рис. 3). Увеличение здесь определяется как соотношение между размером изображения на экране и размером области, которую сканирует луч на образце. Увеличение варьируется от 10 до 10 миллионов.
Взаимодействие сфокусированного электронного пучка с атомами в образце может привести не только к рассеянию, используемому для получения изображения в РЭМ, но и к возбуждению рентгеновского излучения, эмиссии видимого света и вторичной электронной эмиссии. Поскольку SEM имеет только одну фокусирующую линзу перед образцом, можно исследовать «толстые» образцы.
Отражательный РЭМ.
Отражательная СЭМ предназначена для исследования объемных образцов. Поскольку контраст, возникающий при регистрации отраженных, т.е. обратно рассеянных, и вторичных электронов, в основном обусловлен углом падения электронов на образец, изображение показывает структуру поверхности. (Интенсивность обратного рассеяния и глубина, на которой оно происходит, зависят от энергии электронов в падающем пучке. Эмиссия вторичных электронов в основном определяется составом поверхности и электропроводностью образца). Оба сигнала предоставляют информацию об общих характеристиках образца. Благодаря низкой конвергенции электронного пучка можно проводить наблюдения с гораздо большей глубиной резкости, чем с помощью светового микроскопа, и получать идеальные трехмерные микрофотографии поверхностей с очень высоким рельефом. Благодаря обнаружению рентгеновских лучей, испускаемых образцом, рельеф может быть дополнен информацией о химическом составе образца на поверхностных глубинах ~Глубина 0,001 мм. Состав материала на поверхности также можно определить по измеренной энергии, с которой испускаются определенные электроны.
Трудности, возникающие при работе с SEM, в основном связаны с системами записи и электронной визуализации. Полный комплект детекторов включает в себя все функции SEM, а также функции микроанализатора с электронным детектором.
Электронный микроскоп
ХОРОШО. Теперь мы выяснили, как преодолеть физический барьер в оптической микроскопии. Каков второй способ обойти барьер? А что делать, если мы хотим увидеть неорганические вещества или вообще все, что меньше 30 нанометров?
И здесь мы возвращаемся к нашей формуле, которая гласит, что максимальное разрешение равно половине длины электромагнитной волны. И ученые задумались: Зачем использовать видимый спектр, если мы можем взять что-то с очень короткой длиной волны и посмотреть, что находится в коротковолновом спектре!
В любом случае, они решили не мелочиться и сразу использовать электронный луч. В конце концов, длина волны электронов, ускоренных в электрическом поле, составляет около 0,4 ангстрема. Или 0,04 нанометра! Это в 10 000 раз меньше, чем видимый свет! Кстати, если вы не знали, размер атома водорода составляет всего 1 ангстрем. Так давайте же узнаем, что такого крутого в электронных микроскопах!
Источник электронов и линзы
Идея и первый прототип такого микроскопа были представлены в Германии в 1932 году, и выглядел он примерно так!
По большому счету, принцип остался практически неизменным с тех пор, хотя его использование, конечно, стало гораздо более удобным.
Но как это работает?
Если вы смотрели наше классное видео о магии создания процессора или читали этот материал, вы знаете, что для испарения определенных материалов используется сфокусированный электронный луч, а источником электронов служит вольфрамовая нить. В электронном микроскопе все очень похоже. Часто вольфрам служит источником электронов. Тонкая нить нагревается до высокой температуры и начинает испускать электроны в большом количестве.
И тут начинается самое интересное. Эти электроны должны быть ускорены и сфокусированы. Да — для фокусировки точно так же, как вы фиксируете свет в объективе или обычном оптическом микроскопе. Только в этом случае нельзя использовать стеклянные линзы — весь пучок электронов полностью поглощается в первой линзе. Поэтому для этого необходимо использовать электростатические линзы. Это электроды специальной формы, которые генерируют определенное электромагнитное поле. Это позволяет сфокусировать электронный луч и ускорить его до высоких энергий!
Подобно свету, падающему на поверхность материала в оптическом микроскопе, электронный луч предоставляет нам информацию и позволяет реально увидеть образец.
СЭМ
Здесь следует отметить, что в целом существует два основных типа электронных микроскопов, которые сильно отличаются друг от друга.
Первый — это так называемый сканирующий электронный микроскоп или просто SEM.
Здесь сфокусированный пучок электронов ударяет в поверхность образца практически любого размера, и происходят магические физические процессы, которые заставляют одни электроны ударять другие электроны из атомов изучаемого материала.
Эти новые электроны называются вторичными электронами и имеют относительно низкую энергию, поэтому их можно легко обнаружить с помощью специального детектора. Появление этих вторичных электронов очень локализовано, что позволяет получить более точные изображения.
Затем сфокусированный луч начинает сканировать поверхность материала и, в зависимости от рельефа поверхности, разное количество вторичных электронов достигает детектора. Так создается образ.
Именно поэтому все электронно-микроскопические изображения черно-белые. Так что на самом деле это просто вопрос разной интенсивности в разных точках изображения. И каждое цветное изображение в электронном микроскопе — это просто цветное изображение.
SEM являются наиболее часто используемыми микроскопами в процессорном производстве, поскольку они позволяют быстро получить представление о качестве поверхности и обычно используются для контроля на каждом этапе производства.
▎ Сканирующий электронный микроскоп
СЭМ дает изображение с очень высоким разрешением. Узко сфокусированный электронный луч сканирует поверхность исследуемого образца микрометр за микрометром. Помимо прочего, СЭМ позволяет получить трехмерное изображение. Этот тип микроскопа имеет большое количество датчиков, которые могут обнаружить все частицы, перемещаемые электронами: Электроны, спектры видимого инфракрасного и ультрафиолетового света и рентгеновские лучи.
В отличие от PEM, который работает как световой микроскоп, SEM похож на старый телевизор. Эти телевизоры оснащены электронной пушкой. Электроны, испускаемые электронной пушкой, проходят через нее в вакууме, а система линз для коррекции движения может фокусировать или отклонять электроны. В РЭМ все точно так же, за исключением того, что электроны бомбардируют исследуемый объект, а не люминофоры на экране, и вся входящая информация воспринимается разными детекторами. 
ㅤㅤ Сканирующий электронный микроскоп
SEM имеет несколько принципиально различных режимов работы в зависимости от детекторов.
Давайте рассмотрим наиболее важные типы:
Он используется для определения морфологии поверхности образца, поскольку сигнал вторичных электронов особенно чувствителен к рельефу, шероховатостям и неровностям. Этот режим чаще всего используется в биологии для обнаружения пор, канавок и щелей, например, при исследовании бактериальной клетки.
Изображения пыльцы, полученные с помощью вторичной электронной детекции.
— Детектор обратно рассеянных или отраженных электронов.
Используется для определения состава разнородного вещества с многочисленными включениями, поскольку сигнал рассеянных электронов чувствителен к определенному контрасту состава. Таким образом, вещества разного состава в одном и том же объекте будут иметь разные оттенки серого на полученном изображении. Этот метод в основном используется в кристаллографии и биологии.
Морфология границы раздела между оксидом и металлическими элементами, полученная в режиме отраженных электронов.
Позволяет определить элементный состав веществ и включений в образце. Конечно, в большинстве случаев важнее определить химический, а не элементный состав. С другой стороны, энергодисперсионный спектрометр может быть использован для определения состава отдельных микрокомпонентов в одной точке. Кроме того, для этого метода не требуется никаких реагентов. Он используется в химии и кристаллографии.
Анализ элементного состава микрокомпонентов в образце полированного анодного шлака с помощью энергодисперсионного спектрометра.
Электроны, проходящие через тонкий срез образца, достигают детектора под разными углами, предоставляя различную информацию о рассматриваемом объекте. Угол рассеяния зависит от толщины среза, материала образца и энергии первичного электронного пучка. Детектор передает псевдоцветное изображение, причем каждому цвету соответствует свой сигнал. Распространение коррозии через хромирование стали. Изображение получается путем регистрации проходящих электронов.
▎3D моделирование
В некоторых случаях, например, в биологии и медицине, может потребоваться не только фотографирование очень тонких срезов, но и создание трехмерных изображений ткани или организма.
Это можно сделать различными способами:
Первый подход к 3D-моделированию в электронном микроскопе. Процесс заключается в создании полосы из чрезвычайно тонких ломтиков, собранных в специальную сетку, покрытую углеродом и особым веществом — формиаром. Изображения обрабатываются в специальной программе: Создается контур, изображения выравниваются, обрезаются и объединяются в единое 3D-изображение. Процесс объединения является утомительным и длительным, а размер изображения ограничен. Другой проблемой являются значительные зазоры между слоями. Кроме того, очень тонкие секции очень хрупкие и склонны к повреждениям. И чем их больше, тем выше вероятность смещения выборки.
По сравнению с ПЭМ сегментарных срезов, можно увидеть более мелкие структуры, например, от 3 нм, элементы цитоскелета с более высоким разрешением. Однако образцы должны быть достаточно маленькими (100-500 нм). Поэтому ПЭТ не подходит для больших объектов и только для молекулярных комплексов, вирусов и небольших бактерий.
Принцип метода криоэлектронной томографии
В PET объект поворачивается шаг за шагом и фотографируется под разными углами. Затем все изображения объединяются в единое 3D-изображение. Недостатком этой техники является то, что образец подвергается воздействию высокой дозы радиации, поэтому некоторые мелкие детали теряются во время процедуры.
С помощью этого метода можно получить несколько изображений образца на разной глубине, не повреждая поверхность объекта. Этот эффект достигается путем изменения напряжения ускорения электронов. И чем выше энергия, тем глубже электрон может проникнуть в объект. На каждом изображении показана особенность конкретного самолета. А специальный программный алгоритм объединяет несколько секций в 3D-модель с максимальным разрешением 10 нм. Этот метод можно использовать в сочетании с методом ультратонкого среза и др.
4. сканирующая электронная микроскопия с фокусировкой ионного пучка сканирующего электронного микроскопа (FIL-SEM)
Метод, по сути, заключается в разделении исследуемого образца на слои параллельным пучком ионов галлия и сканировании объекта электронным пучком. Толщина слоя составляет 5-10 нм. Полученные изображения собираются в единую трехмерную модель.
Цветное изображение бактериофагов (зеленый), заражающих кишечную палочку (синий) в FIL-SEM.
Сложность метода заключается в подготовке. Перед запуском образец должен быть защищен от части нагрузки. Для этого на сам объект, например, прибор, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта составляет 100*100 мкм. Кроме того, этот метод требует много времени, а качество снижается с увеличением глубины реза.
Принцип метода FIL-SEM
5) SEM с автоматической зоной сбора деталей
По сути, это улучшенная версия метода последовательного среза. Специальный компонент в суперкомпьютере, который производит ломтики, работает автоматически и может производить до 1000 ломтиков в день, помещая их на специальную ленту. Затем лента разрезается на кусочки, помещается на подложку, срезы обрабатываются контрастным веществом и углеродом, после чего нарезанный образец помещается в РЭМ. Полученные изображения имеют разрешение 5 нм.
▎Цветное изображение
Самый большой недостаток EM — это черно-белые изображения. Однако ученым удалось решить и эту проблему.
Самый простой метод — корреляционная светоэлектронная микроскопия (CEM): для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется с помощью светового и электронного микроскопов, а затем программное обеспечение объединяет эти два изображения. Однако из-за разного разрешения изображение имеет лишь радужную окраску, зависящую от распределения флуоресцентного красителя. Микроструктуры нельзя различить таким образом. 
Корреляционная фотоэлектронная микроскопия элементов цитоскелета
Ученые объединили CLEM с трехмерной световой микроскопией, уже известной как FIL-SEM, и микроскопией со сверхразрешением (SR-микроскопией), которая позволяет получить более высокое разрешение путем объединения нескольких изображений на экране.
Срез ядер нервных клеток с помощью микроскопии сверхразрешения
После получения изображения с высоким разрешением ученые проникали в образец ионным пучком. Изображение было окрашено с помощью структурированной световой микроскопии, которая удваивает разрешение изображения путем поочередного освещения отдельных точек, в то время как остальная часть образца остается на заднем плане, и одномолекулярной световой микроскопии, в которой флуоресценция красителя запускается слабым лазером. Световая микроскопия одиночных молекул позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения были сшиты вместе для получения полноцветных изображений. Используя эту технику, мы смогли увидеть, например, суперфлору нейронов.
Трехмерные модели ядер нейронов, полученные с помощью корреляционной микроскопии.
Поэтому электронный микроскоп незаменим во многих областях. Ученые уравновешивают недостатки и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, единственными недостатками скоро станут размер и стоимость. Хотя… Возможно, это тоже можно исправить.
- Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.
- Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.
- СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.
- Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).
- Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x
Измерение увеличения цифрового микроскопа
При сравнении увеличения цифрового оптического микроскопа без окуляров с увеличением обычного оптического микроскопа имеет смысл сравнивать поле зрения, поскольку разные производители микроскопов часто используют разные методы для измерения увеличения своих продуктов. Это особенно актуально, поскольку, в отличие от стандартов для обычных оптических микроскопов, стандарты для определения увеличения полностью цифровых микроскопов все еще находятся в стадии разработки.
Например, некоторые производители измеряют увеличение своих микроскопов при просмотре изображения на 15-дюймовом экране. Другие используют 17-дюймовые экраны. Таким образом, указанное производителем увеличение говорит о чем-то, только если указан размер и разрешение экрана. Это связано с тем, что одни и те же детали будут иметь разный размер на экранах одинакового размера, но разного разрешения. Однако хорошо то, что программное обеспечение, поставляемое с цифровым микроскопом (или камерой), обычно позволяет калибровать изображение и измерять объекты прямо на экране. В любом случае, особенно если микроскоп используется в учебных целях, следует поощрять студентов непосредственно измерять поле зрения и рассчитывать увеличение.
Поле зрения (FoV, от Field of View) — это диаметр освещенного круга, видимого через окуляр микроскопа. В цифровом микроскопе поле зрения определяется как ширина окна изображения на экране монитора. Чтобы оценить увеличение цифрового микроскопа, можно измерить его поле зрения и сравнить его с полем зрения оптического микроскопа с известным увеличением. Вам понадобится микрометрический объект (калибровочный предмет) с градуировкой 0,1 или 0,01 мм, прозрачный для микроскопов в проходящем свете или металлический для микроскопов в отраженном свете.
Чтобы рассчитать поле зрения, поместите микрометрический объект на объективную пластину и отсчитайте количество делений, которые будут измерены в поле зрения цифрового микроскопа. Выполните ту же задачу с помощью светового микроскопа. Затем можно сравнить поля зрения двух микроскопов и определить увеличение цифрового микроскопа.
Нога пчелы. Микрофотографии, полученные с помощью обычного микроскопа (слева) и цифрового микроскопа (справа).
Сравнение традиционного оптического микроскопа с цифровым
Для этого сравнения мы использовали два недорогих микроскопа:
- Цифровой микроскоп Supereyes B011 ($100) с 5-мегапиксельной камерой, объективом L1000 ($85) и координатным предметным столом ($10). Микрофотографии биологических объектов снимали в проходящем свете от простого светодиодного источника света (без конденсора и других оптических элементов, которые имеются в микроскопе с освещением по Кёллеру).
- Традиционный оптический микроскоп с объективом 10×, координатным предметным столом и светодиодным освещением по Кёллеру ($163). Головка с окулярами была снята и взамен была установлена 21-мегапиксельная зеркальная фотокамера с полноформатной матрицей. Для установки вместо головки микроскопа использовался комплект удлинительных колец и конусный переходник. Поле зрения объектива 10× было несколько больше, чем у цифровой микроскопа с объективом L1000 на минимальном увеличении (1,8 мм).
Результаты этого сравнения показаны на четырех микрофотографиях выше. Слева — фотографии, сделанные с помощью обычного микроскопа, справа — с помощью цифрового микроскопа. Нажмите на фотографии, чтобы загрузить увеличенные изображения.
